Монастырь основан в 1371 году Димитрием, ближайшим последователем преподобного Сергия Радонежского. Димитрий принял монашеский постриг в Успенском Горицком монастыре, а вскоре, приняв сан священства, основал неподалёку Никольский монастырь «на Болоте» и стал его игуменом.
Постройка монастыря нашла поддержку у Дмитрия Донского. Дмитрий Донской жертвовал средства на постройку монастыря, в то время как Димитрий Прилуцкий был крёстным отцом его детей.
Первый деревянный храм будущего монастыря был освящён в честь праздника Всемилостливого Спаса, Пресвятой Богородицы, на Происхождение Животворящего Древа Креста Господня, отмечаемого 1 (14) августа. Рядом были построены деревянные кельи для монахов.
Во время игуменства преподобного Димитрия монастырь именовался лаврой. Многие из учеников перешли из Переславля к любимому наставнику в Прилуки, и по примеру Троице-Сергиевой лавры в монастыре, впервые на Русском Севере, был введён общежительный устав. Преподобный Димитрий скончался 11 (24) февраля ок. 1406 года и был погребён в деревянном Спасском соборе, у южной стены рядом с правым клиросом.
Василий Тёмный и его сын Андрей устанавливали для монастыря и его вотчин льготные пошлины. Местонахождение монастыря имело большое значение как с военно-стратегической точки зрения, так и для торговли. Монастырь располагался на пересечении водных и сухопутных путей, ведущих из Вологды в Кириллов, Белозерск и важнейшие русские центры международной торговли XVI века — Холмогоры и Архангельск, а также соединявших Вологду с центрами наиболее доходных промыслов средневековья — солеварения (Сольвычегодск и Тотьма) и промысла рыбы и пушнины (весь Север). Связи монастыря с Москвой были важным политическим моментом, учитывая острую борьбу Москвы и Новгорода за Вологду, продолжавшуюся с XIII до XV века.
Монастырь использовался как место ссылки. В 1493 году сюда были заточены великим князем Иваном III княжичи углицкие Иван и Дмитрий — сыновья углицкого князя Андрея Горяя. Иван скончался здесь в оковах в 1523 году под именем Игнатия (позднее причислен к лику святых под именем Игнатия Прилуцкого), Дмитрию в 1540 году было разрешено снять «железа». Братья были похоронены в монастыре рядом. Иван III брал из монастыря в поход на Казань икону Дмитрия Прилуцкого, написанную Дионисием Глушицким. После похода он украсил икону золотом и серебром, вернув её 3 июня 1503 года монастырю.
В 1528 году в монастыре молились о даровании наследника Василий III и Елена Глинская. Впоследствии их сын Иван IV Грозный своей грамотой 1541 года освободил монастырские вотчинные сёла и деревни на 5 лет от всяких податей. В 1537—1542 годах в монастыре Спасский собор был возведён в камне. Иван Грозный впервые посетил монастырь в мае 1545 года, а в 1552 году брал в поход на Казань Киликийский крест из Спасо-Прилуцкого монастыря.
Вплоть до 1645 года в Спасо-Прилуцком монастыре был обычай после дня памяти преподобного Димитрия 11 (24) февраля игумену монастыря ездить в Москву для поднесения государю и его семейству воды, освящённой на праздничном молебне, и просфоры, из которой была вынута частица за здравие царя и царствующего дома. Игумены монастыря присутствовали на «избирательных» соборах для утверждения на Московском престоле нового царя: в 1598 году Бориса Годунова, в 1613 году Михаила Фёдоровича.
Монастырь существенно пострадал в годы Смуты. В 1612 году на него напали поляки-литовцы и казаки, была разграблена монастырская казна, сожжены архивы. В 1615 году монастырь был разорён сибирским царевичем Арасланом Алеевичем с дворянами, детьми боярскими и казаками, пришедшими на Вологду «для оберегания». В 1619 году монастырь вновь подвергнут разграблению со стороны литовцев и «русских воров». 18 (31) декабря 1619 года в монастыре была сожжена трапезная с находившимися в ней людьми. В этот день было сожжено 59 и убито 32 монаха, а всего погибли более 200 человек.
В конце XVII—XVIII веках монастырь стал одним из богатейших на Русском Севере, одним из крупнейших землевладельцев и торговцев солью.
17 сентября 1811 года Спасский собор серьёзно пострадал от пожара (по преданию, от забытой «грошовой свечи»). Сгорело всё внутреннее убранство, обгорели некоторые главы. Перед вторжением французов в Москву в 1812 году в Спасо-Прилуцкий монастырь были эвакуированы драгоценности патриаршей ризницы, Троице-Сергиевой лавры, Чудова, Новоспасского, Знаменского, Николо-Угрешского, Покровского, Новодевичьего, Вознесенского монастырей и некоторых московских соборов и монастырей. Драгоценности хранились в сгоревшем Спасском соборе до освобождения Москвы. Спасский собор был реставрирован в 1813—1817 годах. Были заменены повреждённые пожаром главы, которым были приданы барочные кувшинообразные формы, устроен новый иконостас.
1918 год начался в монастыре обыском и описью имущества; часть зданий были заняты красноармейцами и складами. Однако еще нескольких лет после этого в Спасском соборе совершались богослужения, действовала часовня в селе Прилуки. Чтобы избежать осквернения национализированных храмов, расхищения богослужебной утвари, книг и святых икон, настоятель организовал при монастыре церковную общину из местных жителей. В 1919 году началось изъятие из монастырских храмов церковной утвари и убранства икон для сдачи в Госфонд, в помощь голодающим Поволжья, продолжавшееся до 1923 года. В один из дней вывезли более двух пудов серебра. Вскоре уездный исполком принимает решение о выселении из монастыря архимандрита Нифонта (Курсина), семи монахов и восьми послушников. Начавшееся закрытие монастыря вызвало протест прихожан, некоторые из них были арестованы и заключены в тюрьму. В августе 1924 года монастырь был закрыт, договор с общиной расторгнут, храмы и колокольни опечатаны. Церковное имущество передали в Вологодский музей, а все остальное – различным учреждениям. С середины 20-х гг. ХХ века все монастырские храмы пребывали в запустении, во Введенской церкви после разборки купола, в 1927–1928 годах, был устроен кино-клуб, буфет, разыгрывались спектакли. Жилые и хозяйственные здания занимали дом инвалидов, пересыльная тюрьма, военные склады и филиал Вологодского музея.
За годы гонений на Православную Церковь не угасла вера вологжан в помощь преподобного Димитрия Прилуцкого. Предваряя открытие монастыря, жители Вологды 16 июня 1990 года, в день праздника Сретения иконы святого Димитрия, совершили Крестный ход по городу до Лазаревского кладбищенского храма – первый после долгого перерыва. Уже в августе 1990 года были переданы церковной общине надвратная Вознесенская церковь, в 1991 году открыт мужской епархиальный монастырь. В день памяти преподобного Димитрия, 24 февраля 1992 года, Русской Православной Церкви возвращен весь монастырь. В 1992 году отмечалось 600-летие преставления преподобного Димитрия Прилуцкого. 13–14 августа Прилуцкий монастырь посетил и возглавил торжество Патриарх Московский и всея Руси Алексий II. На престольный праздник Всемилостивого Спаса Святейший совершил Всенощное Бдение и Божественную Литургию в нижнем храме Спасского собора, водосвятный молебен на реке Вологде, возглавил Крестный ход вокруг обители, после чего был освящен первый большой колокол на монастырской колокольне.
В последнее десятилетие ХХ века молитвами преподобного Димитрия после проведенных ремонтов обитель начала благоукрашаться. В храмах устроены иконостасы, освящены надвратная церковь в честь Вознесения Господня, придел в честь преподобного Сергия Радонежского в нижнем храме, верхний соборный храм в честь Всемилостивого Спаса и Происхождения Честных Древ Животворящего Креста Господня. На древних постройках монастыря и крепостных стенах и башнях сделали медные и железные кровли, началось восстановление и реставрация монастырского подворья в Вологде – храма преподобного Димитрия Прилуцкого на Наволоке (ул. Набережная VI армии, 121).
Монастырская жизнь начала возрождаться братией под началом Высокопреосвященнейшего Максимилиана, архиепископа Вологодского и Великоустюжского, Священноархимандрита обители, ныне архиепископ Песоченский и Юхновский. С 2014 года Священноархимандритом обители стал епископ митрополит Игнатий (Депутатов), сменивший архиепископа Максимилиана на Вологодской кафедре. Здесь сохраняются многовековые традиции монастырских церковных служб: ежедневно совершается полный круг богослужения по древнему чину. С 1992 года в обители 24 февраля совершается празднование памяти преподобного Димитрия Прилуцкого и 1 июня – благоверного князя Иоанна Андреевича Угличского, в монашестве Игнатия Прилуцкого.
В обители располагаются ставленническое отделение Вологодской Духовной Семинарии, подготавливающее будущих священнослужителей Вологодской епархии. Ежегодно в стенах обители проходят Димитриевские образовательные чтения, которые собирают духовенство и работников просвещения для обсуждения возникающих в этой сфере проблем. В восстановлении монастыря большую помощь оказывает Правительство Вологодской области и Попечительский Совет, куда входят руководители ряда местных предприятий.
Архитектурный ансамбль Спасо-Прилуцкого монастыря полностью сохранился. В 1950–1990 годах были проведены реставрационные работы, и обитель вновь обрела внешнее благообразие и известность одного из красивейших монастырских ансамблей Русского Севера. Мощные стены длиною около 950 метров с пятью башнями огромных размеров окружают территорию площадью около 3 гектаров, на которой расположены храмы, а также жилые и хозяйственнее здания, возведенные в XVII–XVIII веках. Центр обители – собор Всемилостивого Спаса и Происхождения Честных Древ Животворящего Креста Господня, построенный в 1537–1542 годах по благословению митрополита Московского Даниила на месте деревянной церкви. Монументальный пятиглавый собор с тремя апсидами, на высокой подклети с трех сторон окружен закрытыми двухэтажными папертями.
В 1642 году в подклети собора был устроен храм во имя святого основателя монастыря, в котором пребывают главные святыни монастыря – под спудом мощи преподобного Димитрия и Игнатия Прилуцких. В дни больших церковных праздников на гробницу преподобного Димитрия по обычаю вместо иконы возлагают вышитый покров. По сторонам гробницы находятся две чтимые иконы. Одна – копия-список чудотворного образа преподобного Димитрия с житием и с ней игуменский посох и часть вериг Святого. Другая – Пресвятой Богородицы «Страстная», написана иконописцами монастыря Кутлумуш на Афоне в память о несохранившейся келейной иконе преподобного Димитрия. Пречистая Богородица явила помощь афонским инокам в ХIII веке, во время нападения пиратов на монастырь. Благодаря вмешательству Божией Матери он стал невидим в тумане и избежал разорения, а икона Ее получила название «Фовера Простасиа» – «Страшная Защита». Близ гробницы преподобного Игнатия Прилуцкого пребывают вериги, по преданию носимые подвижником, а также ковчег с частицами Ризы Господней, мощей святителей Иоанна Златоуста и Василия Великого, Сорока мучеников Севастийских, преподобного Иоанна Дамаскина. Особенно почитаема в обители икона Божией Матери «Скоропослушница» – список чудотворного афонского образа, который был создан иконописцами на Святой Горе и привезен в обитель в 1910 году. Каждую пятницу перед этой иконой братия совершает молебен Пресвятой Богородице. Местно почитаемая древняя Казанская икона Божией Матери в драгоценной ризе после закрытия монастыря оказалась в Вологодском музее, но неоскудевающая милость Божия даровала утешение братии и прихожанам другими Ее иконами.
В верхнем этаже (до устройства церкви в подклети) в алтарных апсидах находились, кроме главного, храмы во имя преподобного Димитрия Прилуцкого и св. апостола Иоанна Богослова, с 1782 года – Преображения Господа Иисуса Христа; в XVIII–XIX веках имелись храмы в папертях – св. благоверного князя Александра Невского и мучеников Платона и Романа. Древнее убранство собора погибло при пожаре 1811 года, а созданные после ремонта ампирный иконостас и стенная роспись XIX века – после закрытия монастыря. Высокое крыльцо и ризничная палатка, примыкающая к собору с северо-восточной стороны, дошли до нас в перестроенном виде. Близ алтаря собора находится колодец, по преданию ископанный преподобным Димитрием с часовней над ним. Из него берут воду для водосвятных молебнов, которую как цельбоносную святыню увозят прихожане и паломники.
Большая монастырская колокольня, стоящая на соборной площади, построена в середине XVII века. После разборки шатрового завершения она была надстроена и увенчана луковичной главкой (1720-е годы). При этом была утрачена большая часть первой соборной колокольни, примыкающей к северо-западному углу паперти. На обеих колокольнях под ярусами звона прежде были устроены церкви – во имя святителей Иоанна Златоуста, Василия Великого, Григория Богослова и св. Алексия, человека Божия.
На юго-западной стороне соборной площади расположен трапезный комплекс, состоящий из нескольких зданий на высоких подклетях. К одностолпной трапезной палате примыкает небольшая трапезная церковь в честь Введения Пресвятой Богородицы во храм, келарские келлии и так называемая Белая палата (1675 г.). В подклетях располагались хозяйственные монастырские службы (хлебная, стороженная) и погреба. Трапезная палата соединена со Спасским собором каменным двухэтажным переходом.
Церковь св. великомученика Феодора Стратилата построена мастером Тимофеем над главным входом в монастырь – Святыми вратами (1588–1590). Она имеет необычную двухстолпную конструкцию; завершение надвратного, как и трапезного храма, ярусами килевидных кокошников и орнаментальные пояса повторяют мотивы архитектуры собора Всемилостивого Спаса. После пожара 1815 года и реставрации 1990-х годов надвратная церковь освящена в честь Вознесения Господня. Колокольня ее с шатровым завершением переделана в 1729–1730 годах из часовни, на которой имелись колесные часы и колокола (конец XVII в.).
На северной стороне от собора Всемилостивого Спаса находится так называемая больничная церковь, которая замыкает с востока двухэтажное здание братско-настоятельских келлий. Она была сооружена на месте больничных келлий в 1721 году и освящена в честь святителей Иоанна Златоуста, Василия Великого, Григория Богослова; в конце XIX века перестроена и освящена в честь Всех Святых.
Деревянная церковь в честь Успения Пресвятой Богородицы (I половина XVI в.) перевезенная в 1962 г. из Свято-Успенского Александро-Куштского монастыря, сохраняется в Спасо-Прилуцком монастыре как один из самых древних памятников шатровой архитектуры Вологодского края.