История кафедрального собора началась в первой половине XVII ст., когда здесь было возведено первое молитвенное сооружение. Однако в 1697 г. во время сильного городского пожара здание сгорело, и на его месте построили вторую церковь, которую постигла та же участь - в 1766 г. она сгорела.
В сентябре 1768 г. началось строительство третьего, но уже каменного храма. Название оставили прежнее - в честь иконы Знамения Божией Матери. Освящение обители состоялось спустя 33 года в сентябре 1801 г. Храм состоял из главного здания, трапезной, крыльца с круглыми колоннами и притвора с колокольней. В трапезной по правую сторону находился теплый придел, освященный в 1775 г. в честь Иоанна Златоуста. Здесь совершались только зимние богослужения. Главный престол храма был для служб летнего периода. В мае 1820 г. при церкви начало действовать Знаменское приходское училище.
В конце 1850 г. был утвержден план реконструкции Знаменского храма, который предусматривал расширение и переделку его из холодного в теплый. Реконструкция церкви производилась на средства, пожертвованные тюменским купцом-меценатом И. В. Иконниковым. В ходе ведущейся в 1851-1862 гг. реконструкции церкви, северный придел был разобран, построили южный, в честь святителя Иоанна Златоуста, но в конце XIX ст. он сгорел. Одновременно с реконструкцией здания храма в церковной ограде был высажен сад. В 1901 г. к церкви были пристроены приделы – в честь святителя Иоанна Златоуста и в честь иконы Божией Матери «Скоропослушница», а в 1904 г. - северный придел, Никольский. В 1913 г. в церкви состоялось торжественное событие - Знаменский храм из приходского переименовали в соборный.
В 1930-е гг. в храме размещалось общежитие курсантов, а после - пересыльная тюрьма и машинно-тракторная станция. С 1933 по 1941 гг. собор снова вернули верующим. Однако, с началом войны, его вновь отобрали и использовали в качестве места для размещения военнослужащих. Через четыре года после победы собор был вновь возвращен верующим.
В июне 1994 г. в Знаменском соборе впервые за многие десятилетия был совершен Крестный ход. В настоящее время Знаменский кафедральный собор остается главным собором Тюмени.