В документах XVI — начала XVII вв. Никольский храм упоминается как деревянный.
В 1649 г. построен каменный собор, отчего стал называться Николой Белым.
«Это была первая каменная церковь в городе и на посаде, вторую подобную церковь построили в сельце в честь жен-мироносиц, затем третьим каменным храмом стал Троицкий собор в 1696 г.», — написал П.Симсон в «Истории Серпухова».
Предположительно, в строительстве первой каменной церкви Николая Чудотворца, предшественницы нынешней, участвовали зодчие из Ярославля.
В 1713 г. издан указ о постройке новой каменной церкви во имя святителя Николая. Инициатор постройки — подьячий Земской избы Серпухова Михаил Попов. В 1721 г. храм освятили. Здание сложили из тесаных блоков местного известняка.
В 1831 г. архитекторы Ф.М.Шестаков и И.Т.Таманский (ученик М.Ф.Казакова) составили проект перестройки церкви. В 1835 г. началось строительство ныне существующего Никольского храма с приделами во имя святителя Алексия, Митрополита Московского, и преподобного Кирилла Белоезерского.
Возведенный в 1835—1857 гг. храм Николы Белого является прекрасным образцом московского ампира. Он выстроен из кирпича и оштукатурен, украшен белокаменной отделкой.
В 1924 г. храм посетил святитель Тихон Московский, который присвоил храму статус кафедрального собора. После закрытия Владычнего женского монастыря, почитаемый в городе образ Божией Матери «Неупиваемая Чаша» находился в храме Николы Белого. В 1929 г. храм закрыли. По рассказам старожилов, иконы собора сожгли на льду реки Нары. Колокольню частично разрушили, образ святителя Николая на внешней стене храма постоянного подвергался надругательствам, но всякий раз на следующее утро обновлялся.
Некоторое время в храме находилась городская макаронная фабрика. Во время войны здесь устроили прачечные. Перед тем, как храм открыли, помещение использовал штаб гражданской обороны под склад, который размещался в соборе с главной целью — избежать сноса храма.
В 1995 г. храм возвратили верующим как подворье Высоцкого монастыря, с 1998 г. он стал приходским. В 1999 г. на средства благотворителей, городской администрации и горожан были приобретены колокола.
Духовенство собора опекает и окормляет Серпуховский военный институт, следственный изолятор, детские приюты и интернат.